La asignatura está destinada a alumnos de la carrera de Lic. en Biología
Molecular.Está orientada al análisis de los procesos de reconocimiento
molecular, procesos que juegan un rol importante para determinar la respuesta
de las células a los diferentes estímulos provenientes del medio ambiente
en que se desarrollo la misma. En el curso se estudiarán procesos de reconoci-
miento molecular tales como hormona-receptor, droga-receptor, moléculas de
adhesión celular y procesos relacionados, desde el punto de vista físico-químico,
bioquímico y farmacológico. Recepción del mensaje y transducción del mismo
Recepción del mensaje y transducción del mismo al medio intracelular
que desencadene la respuesta fisiológica. Se analizan las diferentes
metodologías para el estudio de la interacción ligando receptor y de
sus mecanismos de transducción. Análisis del problema desde una metodo-
logía bioquímica y de biología molecular.
El curso tiene una modalidad teórico-práctica, con activa participación
de los alumnos,a través de seminarios y discusión de problemas.
Los Trabajos Prácticos de laboratorio, requieren de una modalidad en
un módulo compacto de 40 hs, que se dictan en una semana dedicada
exclusivamente a la práctica.

Programa Desarrollado

TEMA 1. El problema del reconocimiento molecular subyacente en procesos
bioquímicos, tales como: hormona-receptor, droga-receptor, enzima-
sustrato, DNA-binding protein, etc. Procesos físico-químicos que
determinan el reconocimiento molecular. Tipos de energías de interac-
ción que participan en los procesos mencionados.

TEMA 2. Técnicas bioquímicas: técnicas de uso común del laboratorio
bioquímico. Métodos separativos: filtración por tamices moleculares.
Cromatografía por intercambio iónico. Cromatografía de afinidad:
aplicación a la purificación de proteínas, ARN, anticuerpos y otros.
Ultrafiltración. Solubilización y concentración de proteínas. Princi-
pios de separación y aplicaciones. SDS-Page. Separación de proteínas.
Western e inmunoblotting para la identificación de proteínas. Inmuno-
precipitación como método de análisis, identificación y purificación
de proteínas. Ultracentrifugación: método de las velocidades y métodos
del equilibrio de sedimentación. Aplicaciones a la purificación de
plásmidos y DNA. Ventajas y desventajas de las diferentes metodologías.
Aplicaciones.

TEMA 3. Receptores. Concepto de receptores. Propiedades que definen a
un receptor biológico. El enfoque farmacológico vs. el enfoque bioquí-
mico. Teoría de receptores. Curva de saturación. Gráfico de Scatchard.
Diferentes posibilidades experimentales. Estimación del Kd y N.
Significado de los sitios de binding. Cinética del binding de receptor
es Curvas de asociación-disociacion: equilibrio de la interacción
ligando receptor. Estimación del Kd a partir del estudio cinético.
Estudios de competencia: curvas de desplazamiento. Estimación de IC50
y Ki. Métodos de estudio y análisis de resultados.

TEMA 4. Receptores de membrana: aspectos prácticos del estudio de
receptores de membrana. Métodos de preparación. Ensayo de binding.
Métodos de separación del ligando \'libre\' del ligando \'unido\'.
Solubilización de receptores. Aspectos experimentales. Caracterización
bioquímica y molecular de los receptores. Análisis de casos. Resolución
de problemas. Clonado de receptores: diferentes metodologias.

TEMA 5. Clasificación de los receptores sobre la base de su estructura
y mecanismos de transducción. Mecanismos de transducción. Estructura
de los receptores y mecanismos de transducción. Diferentes tipos de
señales según el tipo de receptor. Receptores acoplados a canales
iónicos. Ejemplos. Receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Receptor
es con propiedades autocatalíticas: autofosforilación y fosforilación
de proteínas.

TEMA 6. Modelos de receptor. Modelo de dos estados del receptor y
modelo de tres estados. Mutantes CAM: mutantes constitutivamente
activadas. Significado biológico de las mismas. Situaciones patológica
s. Resolución de problemas. Regulación ´up´y ´down´ del ´numero de
receptores. Reciclado de receptores vs. síntesis de novo y regulación de
la síntesis. Desensibilización.


TEMA 7. Proteínas G. Diferentes tipos de proteína G y su acoplamiento.
Estructura y rol de las diferentes subunidades. Biología Molecular de
proteínas G. Homología entre las diferentes proteínas G. Identifica-
ción immunológica de las diferentes subunidades. Control dual de la
adenilato cidasa. Acoplamiento a la adenilato cidasa vía la subunidad
alfa s (estimulatoria) o alfa i (inhibitoria). Activación de proteína
quinasa A (PKA).

TEMA 8. Equilibrio del acoplamiento receptor-proteína G. Efecto del
sustrato.Estudios de reconstitución. Sitios regulatorios mediante
toxina del cólera y toxina pertusis. La familia de las proteínas G.
Proteínas G menores, transducinas, protooncogenes. Métodos de estudio
y caracterización de la asociación receptor-proteina. Alteraciones en
la expresión de proteínas G durante el desarrollo, transformación,
diferenciación y estados patológicos.

TEMA 9. Mensajeros intracelulares: formas de acoplamiento, señalización
intracelular y sus métodos de estudio. Ensayos in vitro o in vivo
para el estudio de la respuesta biológica. Metabolismo de inositol
fosfato como respuesta a la activación de receptores. Recambio de
fosfolípidos. Proteínas G involucradas. Diferentes niveles de regula-
ción. Activación de proteínas quinasas por DAG (diacilglicerol).
Mobilización de iones Ca y activación de proteína quinasa C. Interac-
ción entre mobilización de Ca y PI turnover. Propiedades de las dife-
rentes proteínas quinasas y formas de estudio de las mismas.

TEMA 10. Receptores autocataliticos. Autofosforilación y proteínas
tirosina quinasas. Mecanismos de fosforilación y defosforilación de
proteínas, un delicado equilibrio. Activación de tirosina quinasas.
Estructura del dominio catalítico. Proteínas tirosina fosfatasas.
Cascadas de proteínas fosforiladas y activacion de MAP quinasas.
Relación con procesos de desarrollo y regulación génica. Interacción
en la activación de diferentes proteínas quinasas.

TEMA 11. El NO como intermediario en la transducción de señales.
Interrelación entre distintas células mediada por la formación de NO.
Rol neuroprotector y neurodegenerativo. NO sintetasa. Diferentes
isoformas. Modelo estructural, comparación con citocromo P450.
Inhibidores de NOS. Guanilato ciclasa soluble. Secuestradores de NO.

TEMA 12. Procesos de reconocimiento celular. Moléculas de adhesión
(CAM; NCAM; etc.). Selectinas. lntegrinas. Rol de las mismas en
procesos biológicos.Importancia de la porción glicosídica de estas
proteínas.

TRABAJOS PRACTICOS:

1. Calibración de una columna de exclusión por tamaño molecular.
Separación de proteínas del suero en una columna P-100.

2. Preparación de membranas a partir de tejido de rata.

3. Determinación de la concentración de proteínas mediante absorban-
cia a 280 nm y mediante la metodología de Bradford.

4. Separación de proteínas mediante SDS-PAGE.

5. Transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF.

6. Fosforilación de proteínas mediada por la activación de receptores
de membrana y reconocimiento de proteínas tirosin fosforiladas median-
te Western blot

7. Activación de Proteína quinasa C (PKC) y detección por traslocación
a membrana mediante Western blot.

8. Uso del programa INPLOT para realizar un análisis estadístico de
datos experimentales y su graficación.

SEMINARIOS: se propondrán seminarios de discusión de trabajos de
reciente publicación sobre los temas desarrollados durante el curso
de las revistas Cell, J.Biol. Chem., Nature u otros de interés para
el desarrollo del curso.

EVALUACION: Se propone una evaluación continua del curso con posibili-
dad de Promoción sin examen, para lo cual se deben cumplir los siguien-
tes requerimientos:

a. Se requiere una asistencia del 80 % a las clases teórico-prácticas.
b. Se realizará una evaluación continua del alumno a través de su
participación en clase y mediante seminarios a presentar por los
alumnos.
c. Aprobación de tres evaluaciones parciales, con caracter teórico-
práctico y metodología a libro abierto combinada con preguntas de
opción múltiple.
d. Para mantener la condición de alumno promocional, los parciales
deben ser aprobados en primera instancia.
e. Aprobación de los trabajos prácticos de laboratorio, los cuales
tienen el carácter de irrecuperables por sus características y el
costo de los mismos.
f. Evaluación integradora que puede consistir en un seminario final,
investigación bibliográfica o propuesta de un plan de trabajo y
seminario, determinado por el profesor oportunamente.

Para alumnos regulares:
Se deben cumplir los requisitos anteriores, a excepción del f, con
las siguientes modificaciones:
a. Asistencia requerida 70%.
b. Régimen de recuperaciones: de acuerdo a las ordenanzas vigentes.